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1 プラスミドをテンプレートにPCRしてクローニングする
kyamaguc
投稿師

山口勝司 2006-4-27 19:40  [返信] [編集]

そんなこと知っているよと言われるかもしれませんが・・・
どでかいプラスミドをテンプレートにして、自分のほしい領域の配列をPCRで増やす。
分子生物学的な実験では良くやることだと思います。
そのほしい領域をクローニングなどに使っていきたい場合、もっとも手っ取り早く簡単に精製するにはどうしたらよいでしょう。
TAクローニングするベクターに対していきなり混ぜて、ライゲーションしても低効率ですが、それなりにうまくいくようです。
PCRプライマーにあらかじめ、はめ込むための配列を付加させておくともっと良いでしょう。
もう1つ問題なのは、元のテンプレートであるプラスミドが反応液中に残っていることです。耐性マーカが次にクローニングするベクターと違えば無視できます、同じだとテンプレートプラスミドを除かなければなりません。
簡易カラムはバッファ交換するのは簡単ですが、PCR産物DNAとテンプレートのプラスミドDNAを分けることはできません。
フラグメントをアガロースゲルで切り出して精製するのが普通でしょうが結構時間がかかり面倒です。
テンプレートDNAにあって、PCR産物にない制限酵素であらかじめ切断しておくのも手ですが、どでかいプラスミドの場合、切れたフラグメントサイズと目的のPCR産物の大きさの組み合わせを考えると、なかなか頭が混乱してきます。それにプラスミドの制限酵素地図を調べるのも面倒です(市販のものなら良いですが)。

で、こんな方法があるぞということを次に書きます。
2 Re: プラスミドをテンプレートにPCRしてクローニングする
kyamaguc
投稿師

山口勝司 2006-4-27 19:44  [返信] [編集]

今回のネタの結論。
DpnIとかのようにメチレーションされたDNAしか切断できない制限酵素で処理すると手っ取り早い。
DpnIはGATCの4ベースカッターの制限酵素ですがアデニンがメチル化されてないと切断されません。
普通のdam+の大腸菌ならこの配列はすべてメチル化されているので、4ベースカッターであることも含め、テンプレートゲノムのDNAはズタズタに切断されます。が、PCR産物はメチル化されていないので切断されず、めでたくPCR産物のみが残るというわけです。
DpnIとかは他にも色々応用が利く制限酵素だと思っています。
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